当今社会，经济发展环境复杂多变，使食品安全问题遭遇到严峻的挑战与考验，如何采取可靠技术方法与控制措施，切实提升食品微生物检测成效，成为业内广泛关注的焦点课题。
说明在一定的转速范围内，增加均质转速组织细胞的破碎程度更加彻底，利于多糖的溶解、传质，提取得率快速增加。从扫描电镜图可观察到热回流4h后的五味子样品放大600倍时，五味子细胞组织的微观结构相对比较完整，而将均质酶解提取后的样品放大400倍，观察到细胞组织的微观结构有较大程度的破碎，这是在分散机的强剪切和酶解的共同作用下细胞组织有较大程度的破碎，便于多糖的快速溶解、扩散，提取得率大幅提高、时间极短、能耗降低。
2、响应面优化（1）BBD试验方案及结果在单因素试验基础上，固定果胶酶加酶量1.33%，溶剂原料比25mL/g，选取提取温度（A）、均质转速（B）和提取时间（C）这三个显著因素为考察变量素，每个因素取三个水平，进行BBD试验，以多糖提取得率（Y%）为响应值，对提取工艺条件进行响应面优化。（2）响应面分析及工艺优化利用Box-Behnken软件，根据建立的回归方程作出3D响应面图（图3）。此数据表明，该模型拟合程度良好，试验误差相对较小。从图3的3D图中分析可知，两因素对提取得率的交互作用由大到小依次为闪提速率和提取温度＞提取时间和提取温度＞闪提转速和提取时间。3、不同提取工艺提提取效率的比较分别取3g预处理样品，用均质酶解和热回流提取五味子粗多糖，均质酶解提取得率为10.01%，热回流粗多糖提取得率为7.13%，均质酶解提取的提取得率提高40.39%。
均质酶解提取时间2min，热回流提取时间是240min，时间降低了99.17%。三、结论通过单因素试验考察了各因素对多糖提取得率的影响次序和水平，固定果胶酶浓度为1.33%，采用响应面法优化得到了五味子多糖的最佳均质酶解提取工艺参数：提取时间1.92min，提取温50.82℃，均质转速16319.73r/min，该条件下多糖提取得率为10.01%，与模型预测值9.39%接近，说明建立的模型准确、可靠。从猕猴桃表皮分离到一株黑附球菌菌株YP1，其分泌物具有广谱的抗霉菌活性，对多孢子植物病原真菌也具有很好的抑制效果，在果蔬、食品的保鲜防腐以及植物病害的防治领域显示出很好的应用潜力。
美国应用生物系统公司TripleQTOF5600+质谱仪。（4）拮抗菌株YP1外分泌物对各种霉菌的拮抗效果分析①对霉菌孢子萌发的影响准确称量200mg分泌物固体，将其溶解于稀Na2CO3溶液中，用稀盐酸将溶液的pH调至7.5作为母液备用，母液终体积为50mL，终浓度为4g/L。取上述分泌物母液适量，加入到适量体积液体PDA中，使液体PDA中分泌物终浓度达到200mg/L，以不加分泌物的液体PDA作为对照，两种培养基分装编号。如涉及作品内容、版权等问题，请与本网联系。
分泌物水液对紫外线、强烈日光或120℃以上温度敏感，处理后褪色成为无色物质，在100℃以下温度时比较稳定，干燥固体则不受前述因素影响，表现稳定。3、拮抗菌株YP1外分泌物的发酵制备及其溶解性、稳定性分析YP1菌株在液体发酵过程中可向PDA培养基中分泌橙黄色物质，用盐酸调整发酵液pH4.5，经乙酸乙酯萃取、减压浓缩、吹干，得橙黄色胶状固体，产量为463mg/L（静置培养20d产量），分泌物易溶于极性有机溶剂，在水中的溶解性随着pH的升高而迅速增强，pH5以下难溶于水。
测试霉菌：为本实验室分离保存。（2）拮抗菌株YP1的鉴定使用真菌DNA提取试剂盒提取YP1菌株的总DNA，以总DNA为模板，以ITS1和ITS4为引物对YP1菌株的全长ITS序列进行PCR扩增。然而，由于长期的使用，使得微生物的抗药性也在不断地增强，抗霉菌剂的抗菌效果正在不断下降甚至失效，因此只有不断地开发新的抗霉菌剂资源，多种抗霉菌剂轮换或组合使用，才能有效地应对抗药性，减少果蔬、粮食和食品腐败变质的发生。孢子萌发抑制率=（对照孢子萌发率处理孢子萌发率）/对照孢子萌发率2、拮抗菌株YP1的鉴定以真菌DNA提取试剂盒提取到的YP1菌株的总DNA为模板，以ITS1和ITS4为引物，通过PCR扩增获得了YP1接近全长的ITS序列，测序后送入NCBI官方网站，使用BLAST程序进行在线比对，结果显示其与附球孢菌属的黑附球菌具有最高的相似性（99%），同时YP1菌株的形态和生理特征与王宇等和Fvaro等对黑附球菌的描述一致，因此将其鉴定为黑附球菌。
（3）拮抗菌株YP1外分泌物的发酵制备将YP1菌株斜面菌种活化后，接入盛有100mL液体PDA的250mL锥形瓶中，10瓶共1000mL培养液，28℃静置培养20d左右，弃菌丝，发酵液过滤后合并，用HCl调pH至4.5，1/4体积乙酸乙酯萃取2遍，发酵液中橙黄色物质全部转入乙酸乙酯中，合并乙酸乙酯相，用旋转蒸发仪减压浓缩后，倒入广口皿中用吹风机吹干，得橙黄色胶状固体，称量计算产量。在PDA平板上，YP1菌落平展，菌丝体大部分埋生，初期仅表面为橙黄色，后期整个菌落都变为橙黄色乃至棕黄色，培养基的颜色也由无色变为橙黄色至后期为深棕黄色。2、仪器岛津UFLC-20A高效液相色谱仪。②对霉菌平板生长的影响将固体PDA培养基熔化，冷却至50～60℃时，将上述分泌物母液通过无菌过滤器加入到PDA培养基中，使培养基中分泌物终浓度达到200mg/L，充分混匀后倒平板，将各种供试霉菌菌饼（5mm）分别接入上述已经混有分泌物的PDA平板中央，对照PDA平板不加分泌物，接种霉菌菌饼后作为对照，置于28℃条件下培养，由于不同霉菌生长速度不同，每种霉菌在对照平板接近长满时即停止培养，拍照留底。
4、拮抗菌株YP1外分泌物对各种霉菌的拮抗效果分析以不掺分泌物的液体PDA为对照，通过分泌物掺入和孢子悬浮培养，观察不同霉菌孢子的萌发情况，计算掺入分泌物对霉菌孢子萌发的抑制效果（表1）。植物病原菌：购于中国农业微生物菌种保藏中心。
说明：本文所用图片、文字来源《中国食品添加剂》，版权归原作者所有。分生孢子产生较少，不易被观察，单生，顶生，球形或梨形，深褐色。
一、材料与方法1、材料备筛真菌菌株：共70株，分离于不同种类的植物体，由本研究小组分离保存。扩增产物由北京三博远志公司完成测序。真菌DNA提取试剂盒、ITS1和ITS4引物：购于北京三博远志公司。霉菌的滋生是导致果蔬、粮食和食品腐败变质的主要原因之一，如在我国果蔬损失的25%～30%，粮食损失的10%是由霉菌滋生引起的，其数量庞大的孢子是导致其快速传播繁殖的主要方式，部分霉菌还能产生霉菌毒素，具有致癌性或其他毒性。霉菌有着极强的繁殖能力，主要依靠形形色色的无性或有性孢子进行繁殖霉菌是营寄生或腐生方式生存的丝状真菌的通称，无明显的子实体，这一点与同样营寄生或腐生方式生存但能形成大型子实体的蘑菇类真菌相区别。
（2）拮抗菌株YP1的鉴定使用真菌DNA提取试剂盒提取YP1菌株的总DNA，以总DNA为模板，以ITS1和ITS4为引物对YP1菌株的全长ITS序列进行PCR扩增。取部分固体进行简单的溶解性和光热稳定性分析。
如涉及作品内容、版权等问题，请与本网联系。真菌DNA提取试剂盒、ITS1和ITS4引物：购于北京三博远志公司。
化学试剂：均为分析纯。说明：本文所用图片、文字来源《中国食品添加剂》，版权归原作者所有。
在PDA平板上，YP1菌落平展，菌丝体大部分埋生，初期仅表面为橙黄色，后期整个菌落都变为橙黄色乃至棕黄色，培养基的颜色也由无色变为橙黄色至后期为深棕黄色。3、方法（1）拮抗菌株的初筛黑根霉孢子萌发抑制法：将70株待筛选真菌菌株的斜面菌种活化后，接入盛有100mL液体PDA的250mL锥形瓶中，28℃静置培养20d左右，弃菌丝，发酵液过滤，取9mL发酵液，加入1mL黑根霉孢子悬浮液（生理盐水配制），混匀，另取9mL经10倍稀释的液体PDA，加入1mL黑根霉孢子悬浮液混匀作为对照，待测样品与对照同时置于28℃静置培养6h，悬滴法制片，于显微镜下统计孢子萌发率，通常以芽管长度超过孢子直径的一半作为萌发标准。（5）拮抗菌株YP1外分泌物的化学组成分析将拮抗菌株YP1外分泌物复溶于乙酸乙酯（添加0.1%体积的浓盐酸酸化）中，使其浓度达到0.2mg/mL，取5L上样于高压液相-质谱联用仪，对其化学成分进行分离和鉴定，高压液相采用XDB-C18柱，甲醇（0.1%甲酸+5mM乙酸铵）作洗脱剂，流速0.2mL/min，质谱仪选用ESI电离源，扫描范围：50～2000m/z。将不同霉菌的孢子悬浮液一式两份分别加入到上述两种培养基中，混匀，于28℃静置培养6h，悬滴法制片，于显微镜下统计孢子萌发率。
霉菌有着极强的繁殖能力，主要依靠形形色色的无性或有性孢子进行繁殖。植物病原菌：购于中国农业微生物菌种保藏中心。
从猕猴桃表皮分离到一株黑附球菌菌株YP1，其分泌物具有广谱的抗霉菌活性，对多孢子植物病原真菌也具有很好的抑制效果，在果蔬、食品的保鲜防腐以及植物病害的防治领域显示出很好的应用潜力。3、拮抗菌株YP1外分泌物的发酵制备及其溶解性、稳定性分析YP1菌株在液体发酵过程中可向PDA培养基中分泌橙黄色物质，用盐酸调整发酵液pH4.5，经乙酸乙酯萃取、减压浓缩、吹干，得橙黄色胶状固体，产量为463mg/L（静置培养20d产量），分泌物易溶于极性有机溶剂，在水中的溶解性随着pH的升高而迅速增强，pH5以下难溶于水。
美国应用生物系统公司TripleQTOF5600+质谱仪。（3）拮抗菌株YP1外分泌物的发酵制备将YP1菌株斜面菌种活化后，接入盛有100mL液体PDA的250mL锥形瓶中，10瓶共1000mL培养液，28℃静置培养20d左右，弃菌丝，发酵液过滤后合并，用HCl调pH至4.5，1/4体积乙酸乙酯萃取2遍，发酵液中橙黄色物质全部转入乙酸乙酯中，合并乙酸乙酯相，用旋转蒸发仪减压浓缩后，倒入广口皿中用吹风机吹干，得橙黄色胶状固体，称量计算产量。
扩增产物由北京三博远志公司完成测序。然而，由于长期的使用，使得微生物的抗药性也在不断地增强，抗霉菌剂的抗菌效果正在不断下降甚至失效，因此只有不断地开发新的抗霉菌剂资源，多种抗霉菌剂轮换或组合使用，才能有效地应对抗药性，减少果蔬、粮食和食品腐败变质的发生。将获得的ITS序列送入NCBI官方网站，使用BLAST程序进行在线比对，结合形态学特征确认YP1菌株的最终分类学地位。分泌物水液对紫外线、强烈日光或120℃以上温度敏感，处理后褪色成为无色物质，在100℃以下温度时比较稳定，干燥固体则不受前述因素影响，表现稳定。
迄今为止，人类已经开发了数十种的抗霉菌剂商品（保鲜剂、防腐剂）来应对上述问题，它们在缓解果蔬、粮食和食品腐败变质方面发挥了无可替代的重要作用。取上述分泌物母液适量，加入到适量体积液体PDA中，使液体PDA中分泌物终浓度达到200mg/L，以不加分泌物的液体PDA作为对照，两种培养基分装编号。
分生孢子产生较少，不易被观察，单生，顶生，球形或梨形，深褐色。测试霉菌：为本实验室分离保存。
4、拮抗菌株YP1外分泌物对各种霉菌的拮抗效果分析以不掺分泌物的液体PDA为对照，通过分泌物掺入和孢子悬浮培养，观察不同霉菌孢子的萌发情况，计算掺入分泌物对霉菌孢子萌发的抑制效果（表1）。二、结果与分析1、拮抗菌株的初筛采用黑根霉孢子萌发抑制法从70个真菌菌株中初步筛选到一株对黑根霉的孢子萌发具有强烈抑制效果的真菌菌株YP1，其发酵滤液处理黑根霉孢子，孢子萌发率为0，而对照萌发率为93%，依据如下公式计算抑制率为100%。
